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MALDI-TOF MS已進臨床微生物實驗室 或成細菌鑒定領域“主力軍”

2019/3/21編輯:Ma Liang 人氣:2076

[導讀]隨著科技的不斷進步、相信在不久的將來,MALDI-TOF MS必將成為細菌鑒定領域的“主力軍”。

        隨著技術的不斷成熟和廣泛使用,其在微生物檢驗常規診斷中的作用越來越受到關注,基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術( MALDI-TOF MS)已經進入臨床微生物實驗室。

       自20世紀80年代起,質譜技術就已經成為科學研究中用于蛋白分析的強大工具。隨著技術的不斷成熟和廣泛使用,其在微生物檢驗常規診斷中的作用越來越受到關注,基質輔助激光解析電離飛行時間質譜技術(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)已經進入臨床微生物實驗室用于病原菌鑒定,與傳統的表型鑒定及分子生物學技術相比,MALDI-TOF MS快速、準確、成本低廉,且數據庫可不斷更新完善,極大地提高了臨床微生物尤其是微需氧菌、厭氧菌、分枝桿菌及真菌等難培養微生物的鑒定效率,盡管該技術推向臨床不到10年,現已被公認為微生物快速鑒定的里程碑。

      MALDI-TOF MS基本原理

      MALDI-TOF MS 的離子源通過激光轟擊待測樣品與基質形成的共結晶薄膜,使基質從中吸收能量并傳遞給生物分子,二者間發生質子( 即電荷) 轉移而使生物分子電離。電離的生物分子在電場作用下加速通過飛行管道,根據到達檢測器的時間及離子的數量得到質/荷( m/z) 比值及信號值而形成相應的峰圖。

       微生物由其自身獨特的蛋白質組成,通過比對MALDI-TOF MS 獲得種屬間的特異峰圖( 主要由核糖體蛋白形成,m/z 范圍為2000~20000) 與數據庫中的參考譜圖,根據同源性距離得到最接近的菌種并給出相應的鑒定分值,再依據實際情況分析,可得到最終的鑒定結果。值得一提的是,MALDI與其他電離方式相比具有很多優勢,其電離方式為“軟電離”——整個分子在離子化過程中都能夠保持完整,得出的質譜圖就會讓不同大小的分子有序排布,這樣就便于我們對譜圖進行分析。而其他電離方式更加激烈一些,會導致分子碎裂,最后得出的譜圖會產生很大干擾,造成分析困難。

       MALDI-TOF MS的應用領域

       1.臨床病原微生物

  MALDI-TOF MS 不但可用于分純菌落,也可用于某些特定臨床標本的直接檢測,包括陽性血培養液、中段尿、腦脊液等樣本中微生物的鑒定。該技術也可用于臨床病毒感染的診斷、病毒基因分型和流行病學研究。

  2.食源性微生物

  該技術在飲用水被污染的早期就能直接鑒定出病原菌,已成功用于食品微生物的檢測,并建立了食源性致病菌蛋白質指紋圖譜數據庫。

  3.環境微生物

  MALDI-TOF MS 在環境微生物的鑒定中也日益受到重視,例如海洋、大氣、土壤等特定環境中的潛在致病微生物。以上棲息地的微生物種類繁多,MALDI-TOF MS 在準確鑒定微生物的同時,將來自不同環境和地域的同一種微生物通過MALDI Biotyper 軟件的聚類分析功能進行溯源。目前已經初步建立了環境微生物數據庫。

  4. 其他領域

  MALDI-TOF MS 在新的生物學標志物篩選、新生兒遺傳代謝病臨床應用中也具有很好的應用前景,有可能成為個體化醫療中快速精準的檢測技術。例如先天性甲狀腺功能減退癥、苯丙酮尿癥、囊胞性纖維癥、半乳糖血癥、氧化脂肪酸缺陷癥、有機酸尿癥和尿素循環缺陷癥等。

  MALDI-TOF MS數據庫現狀

  目前主要有4 種MALDI-TOF MS 系統: MALDI Biotyper系統( Bruker Daltonics,德國);VITEK MS 系統( BioMérieux,Marcy l'Etoile,法國);the AXIMA @ SARAMIS 數據庫( AnagnosTec,德國) 和the Andromas( Andromas,法國)。而可購買到的數據庫有3 種: MALDI Biotyper 數據庫( 布魯克道爾頓,德國) ,Saramis( BioMérieux,用于來自Shimadzu 的質譜設備) 和Andromas ( 可與布魯克道爾頓或Shimadzu 硬件兼容)。其中MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統已獲得中國食品和藥品監督管理局的許可證,可用于臨床樣本的檢測。MALDI Biotyper 和VITEK MS 系統對應的臨床微生物基礎數據庫分別為Biotyper 2.0 database 和Vitek MS plus Saramis Knowledge base 2.0。Biotyper 2.0 database中包含的菌種豐富,但缺乏志賀菌( 與大腸埃希菌親緣性過近,常規比對算法無法區分) ,且分枝桿菌、絲狀真菌、布魯氏菌以及霍亂弧菌等所在數據庫需單獨購買; Vitek MS plus Saramis Knowledge base2.0 中包含的菌種少于Biotyper 2.0 database,但擁有霍亂弧菌的數據。

  對于其中缺少的菌種,我們除了通過購買其他數據庫獲得,還可通過自建數據庫來加以完善,那么該如何進行自建呢?

  (1) 通過生化反應或基因測序鑒定并確認待入庫菌的種名;

  (2) 分純單菌落以獲得足量單克隆株;

  (3) 樣本制備: 根據待入庫菌蛋白質提取難度及日后鑒定的需要,靈活選用前處理方法;

  (4) 自動或手動采集質譜譜圖;

  (5) 譜圖評估篩選: 選擇20 ~ 24 張質量較好的譜圖,減小偶然誤差;

  (6) 操作軟件完成建庫。

  MALDI-TOF MS 數據庫擴展完善的重要性

  數據庫是MALDI-TOF MS 的核心,待檢測微生物只有在數據庫里有相應的質譜圖才可能被鑒定。數據庫不僅要包含微生物所有的屬,也應包括種,甚至株。質譜數據庫完善意義重大,具體原因如下:

  1.分類詞目不斷增加,新物種不斷被發現。有時待測微生物未能被鑒定出來是因為它是新的物種或分類。比如過氧化物酶陰性的革蘭陽性球菌有許多新種類,而且其分類也在不斷發展。只有制造商或者用戶把新發現的物種添加到數據庫,按照物種分類詞目的變化去完善數據庫,才能保證新物種的準確鑒定。

  2.有一些物種遺傳背景很相近,親緣性高,增加了鑒別的難度。現在還不清楚是否可以通過優化數據庫或者軟件使一些同源性高度相近的微生物的鑒別成為可能,但像這樣的細節如果不被考慮,就會造成鑒定錯誤。

  3.微生物標本有可能來自不同地域,不同分離基物,有不同分離年限,而且不同地域的優勢菌不同,數據庫中微生物單一的參考質譜圖有時并不能代表分離自其他微生物實驗室的同種典型菌株。所以數據庫中應包含同一個菌種采集的多個分離株的指紋質譜圖,用戶可以將分離的本地典型菌株作為參考菌株填充到自定義數據庫中,必要時可考慮對某些微生物建立本地數據庫,甚至可以建立多地區數據庫聯網共享。

  4.分枝桿菌、厭氧菌等疑難鑒定微生物,其數據庫的建立和完善更為必要。

  5.商業數據庫中對環境微生物的指紋圖譜很少。由于MALDI-TOF MS 越來越多用于鑒定環境微生物,因此構建環境微生物的質譜數據庫是新的研究方向。很多研究也表明,質譜數據庫的擴大可以使鑒定正確率大大提高。例如分枝桿菌在數據庫擴展前后的鑒定正確率分別79.3%和94.9%。因此數據庫的更新和完善是運用MALDI-TOF MS 技術正確鑒定微生物的基礎。

  MALDI-TOF MS未來展望

  MALDI-TOF MS在不久的將來肯定會取代傳統的生化鑒定法,在實驗室大力推廣。在西歐,MALDI-TOF MS已經在臨床實驗室使用,目前FDA和美國抗生素委員會也正在討論將這一方法在臨床推廣,這也將帶來細菌鑒定及耐藥性檢測的革命。

  目前,MALDI-TOF MS仍存在不少問題值得繼續研究改進,比如不同的培養基、培養時間、上樣方式等因素影響實驗的重復性、數據庫尚不完善、從原始標本中直接進行檢測涉及到的最低細菌量以及感染性標本的防護、或是在同一標本中分離出多種進化程度相近的物種則會難以辨別等等。但是另一方面,由于該項技術具備快速、靈敏、準確、經濟、分辨率高、對原始樣本要求低等優點,令其在臨床微生物領域具有很大的發展前景。隨著科技的不斷進步、相信在不久的將來,MALDI-TOF MS必將成為細菌鑒定領域的“主力軍”。

本文來源:臨床質譜檢測                               
編輯:FANGHUIJIE                                 

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(來源: 臨床質譜檢測 )

標簽:質譜,微生物鑒定,儀器,設備

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